案例分享 - 歐易助力發現lncRNA調控胃癌的新機制

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長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度大於200nt，不編碼蛋白的RNA。lncRNA在表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，與多種癌癥息息相關，包括乳腺癌、胃癌、肺癌和前列腺癌等。研究的方面主要集中在腫瘤細胞的轉移、侵襲、增殖和凋亡等。因此，lncRNA目前是生命科學領域的一個研究熱點。今天就通過歐易客戶最新發表的一篇文章，為大傢介紹一下lncRNA參與調控胃癌的新機制。

文章的通訊作者是上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的王紅霞教授、上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院的張建軍教授和復旦大學附屬中山醫院的劉天舒教授。文章於2018年2月發表在Cell Death & Disease（影響因子：5.965）。其中，文章中lncRNA的芯片檢測由歐易生物完成。
文章概述：


作者通過篩選lncRNA尋找胃癌診斷的標記物和預後檢測的靶標，探索其在胃癌中的作用機制。通過從表型到機制再到應用的思路，可以將文章框架分為三個部分。第一部分，作者首先對20對組織（胃癌及對應癌旁組織）進行lncRNA芯片篩選，最終鎖定瞭PANDAR（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA），並證實PANDAR可以作為胃癌診斷的標記物和預後檢測的靶標。隨後，在第二部分，作者探討瞭PANDAR在癌癥發展中的作用機制，發現PANDAR可以競爭性結合p53蛋白調控CDKN1A基因的轉錄。第三部分，找到瞭PANDAR的作用機制後，作者通過體內實驗證明敲除PANDAR聯合nutlin3可以抑制腫瘤細胞的生長，具有明顯的抗腫瘤效應，因此可能成為潛在的腫瘤治療靶點。
研究背景：
1. 胃癌是威脅人類生存和健康的巨大殺手。文獻證實lncRNA與腫瘤細胞的轉移、侵襲、增殖和凋亡息息相關，研究lncRNA在胃癌中的表達和作用機制，有助於我們找到胃癌診斷的標記物和治療靶點。
2. PANDAR是一個較新穎的lncRNA，與腫瘤發展、淋巴結轉移等相關。
3. p53是與癌癥密切相關的轉錄因子，在DNA出現損傷後，可以引發細胞周期停滯或者消滅細胞，具有促進細胞周期停滯和細胞凋亡功能。
研究內容：
1. 胃癌病人中PANDAR的過表達表明病情在惡變
作者首先對20對組織（胃癌及對應癌旁組織）進行lncRNA芯片篩選，最終鎖定瞭PANDAR （Fig. 1A，B，C）。PANDAR的表達與腫瘤大小（Fig. 1D）、TNM階段（Fig. 1E）和死亡率（Fig. 1F）顯著相關。隨後，作者通過ROC分析表明PANDAR可以作為一個標志物區分胃癌早期組和健康組（Fig. 1G）、胃癌轉移組和非轉移組（Fig. 1H）、化療耐藥組和非耐藥組（Fig. 1I）。

圖1. PANDAR對胃癌病人診斷和預後的意義

2. PANDAR促進胃腫瘤細胞的惡性發展
作者發現胃腫瘤細胞中PANDAR的表達量顯著高於正常細胞（Fig. 2A，B），並認為PANDAR的高表達可能是由於其啟動子的去甲基化造成的（Fig. 2C）。之後，作者利用CRISPR/Cas9敲除PANDAR，發現敲除PANDAR後的腫瘤細胞增殖和克隆形成能力顯著下降（Fig. 2D，E，F）、細胞凋亡活性提高（Fig. 2G）。過表達PANDAR發現，腫瘤細胞增殖和克隆形成能力顯著上升（Fig. 2H，I，J）、細胞凋亡活性下降。由此，PANDAR促進瞭腫瘤細胞的惡性發展。

圖2. PANDAR促進胃腫瘤細胞的惡性發展
3. PANDAR通過p53蛋白調控CDKN1A基因的轉錄通過PANDAR的敲除和過表達，作者找到瞭PANDAR的靶基因CDKN1A（Fig. 3A，B）並發現PANDAR和p21呈劑量依賴性關系，當敲除p53後，p21的表達量並沒有變化（Fig. 3D）。因此，PANDAR是通過p53蛋白調控CDKN1A基因的轉錄。


圖3. PANDAR調控CDKN1A的表達
4. PANDAR幹擾p53蛋白和CDKN1A啟動子的結合作者設計瞭一個競爭性的實驗探究PANDAR和p53的關系（Fig. 4A，B）。通過檢測殘餘的p53蛋白的量發現，PANDAR可以幹擾p53蛋白和CDKN1A啟動子的結合（Fig. 4C，D）。隨後，作者用腫瘤細胞總RNA代替合成的PANDAR，再次驗證瞭上述結果（Fig. 4E，F，G）。敲除PANDAR後，p53蛋白保持與CDKN1A啟動子的相互作用，形成p53:CDKN1A復合物（Fig. 4H，I，J）。所以，作者認為PANDAR幹擾p53蛋白和CDKN1A啟動子的結合。

圖4. PANDAR幹擾p53蛋白和CDKN1A啟動子的結合
5. PANDAR直接與p53蛋白相互作用基於PANDAR可以幹擾p53和CDKN1A啟動子結合，作者想知道PANDAR能否和p53直接相互作用。利用RIP和RNA pull-down實驗作者發現PANDAR可以直接與p53蛋白相互作用（Fig. 5A，B），並找到瞭各自的互作部位（Fig.5 C，D，E，F，G，H，I，J）。

圖5. PANDAR直接與p53蛋白相互作用

6. 敲除PANDAR聯合nutlin-3可以抑制體內胃腫瘤細胞的增殖並誘導細胞凋亡通過敲除PANDAR聯合nutlin-3處理腫瘤細胞發現，p21蛋白的表達量升高（Fig. 6A）、細胞復制周期停滯（Fig. 6B）、細胞凋亡活性提高（Fig. 6C），並證明兩者具有協同作用（Fig. 6D，E，F）。體內實驗表明，敲除PANDAR聯合nutlin-3可以明顯減少腫瘤的大小和重量（Fig. 6G）以及抑制腫瘤細胞繁殖（Fig. 6H）。因此PANDAR可能成為潛在的腫瘤治療靶點。

圖6.消耗PANDAR聯合nutlin-3可以抑制體內胃腫瘤細胞的增殖並誘導細胞凋亡
文章亮點：
1. 通過lncRNA芯片精準篩選到瞭目標分子，找到瞭胃癌診斷的標記物和預後檢測的靶標，研究瞭lncRNA對靶基因的調控機制並探索瞭lncRNA在癌癥治療中的潛在應用（表型-機制-應用）。
2. 文章數據量豐富，分別從各類表型（細胞復制周期、腫瘤大小、TNM階段）、多種實驗手段（RIP、qRT-PCR、RIP、Western Blot、RNA pull-down等）、不同表達水平（體內、體外）等解析和驗證。
參考文獻：
Liu J, Ben Q, Lu E, et al. Long noncoding RNA PANDAR blocks CDKN1A gene tranion by competitive interaction with p53 protein in gastric cancer[J]. Cell death & disease, 2018, 9(2): 168.
永兵 撰文
TC 、一棵麥子 整理編輯
本文系歐易生物原創
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by qcds894259

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