項目文章 - 歐易助力探索組蛋白甲基轉移酶BmAsh2參與piRNA介導的傢蠶性別決定

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<p>性別決定機制是一個層級調控的過程，在不同物種中呈現高度多樣性。其中，傢蠶作為鱗翅類模式昆蟲，其性別決定為WZ型，目前已證實Fem作為一種PIWI-interacting RNA (piRNA)，為鱗翅類昆蟲中一類初級性別決定因子，分佈於W染色體性別決定區域，通過與PIWI蛋白結合發揮功能。</p>
<p>性別決定機制高度多樣化，說明有眾多因子參與其中。在小鼠、傢蠶、果蠅等物種中，均有研究表明表觀修飾（包括組蛋白甲基化）可調控基因的表達從而決定生殖細胞復制、X染色體基因失活、生殖腺分化等，從而決定性別。但在傢蠶中，組蛋白甲基化是否參與由piRNA介導的性別決定機制尚未知。</p>
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<p><strong>1、</strong><strong>PIWI蛋白主要在傢蠶生殖腺內表達</strong></p>
<p>PIWI蛋白在生殖腺特異性表達這一特性已經在傢蠶及其它物種中得到證實。作者利用qRT-PCR技術對兩個PIWI蛋白編碼基因，BmSiwi（圖1.A）和BmAgo3（圖1.B）的表達水平進行檢測發現PIWI蛋白在生殖腺特異性表達；檢測第5齡幼蟲 (L5D1) 至成年期（A）期BmSiwi（圖1.C）和BmAgo3（圖1.D）在生殖腺內的表達水平發現PIWI蛋白在成年期表達水平約提高10倍。此外，作者通過免疫染色技術從翻譯水平檢測PIWI蛋白在生殖腺中位置（圖2），由此推測PIWI蛋白在生殖發生階段發揮功能。</p>
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<p style="text-align: center;">圖1. 不同組織和不同時期BmPIWIs在傢蠶生殖腺中表達譜</p>
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<p style="text-align: center;">圖2. BmVasa, BmPIWIs (BmSiwi和BmAgo3) 和 BmAsh2 在傢蠶生殖腺中位置</p>
<p><strong>2、</strong><strong>BmSiwi和BmAgo3中，隻有BmSiwi參與傢蠶性別決定</strong></p>
<p>作者利用CRISPR/Cas9系統構建PIWI蛋白突變細胞系，通過組織學分析驗證基因敲除效果（圖3.A）。通過對Δsiwi 和 Δago3 成熟雌性個體表型分析發現Δsiwi雌性個體卵子形成減少，繁殖能力明顯下降並出現部分性別逆轉（圖3.B、C，圖4），表明BmSiwi調控傢蠶雌性異型。Bmdsx可變剪切和BmMasc的表達水平是雄性化的兩項特征，Δsiwi突變體中，檢測到Bmdsx發生可變剪切並且BmMasc的表達水平升高（圖5），由此推測BmSiwi通過調控Bmdsx和BmMasc來控制傢蠶雌性異型。</p>
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<p style="text-align: center;">圖3.突變體中卵子發生情況 </p>
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<p style="text-align: center;"> 圖4. Δsiwi 和Δash2 雌性個體部分性別逆轉</p>
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<p style="text-align: center;"> 圖5. 在WT和突變體中Bmdsx可變剪切及BmMasc表達水平</p>
<p><strong>3、</strong><strong>BmSiwi</strong><strong>和BmAgo3突變動物模型中piRNAs和TEs發生調節異常</strong></p>
<p>作者通過對突變體幼蟲階段的卵巢組織進行RNA測序分析，與WT相比，Δsiwi突變個體中差異基因數遠高於Δago3突變個體，都有差異基因富集到GO條目“reproduction”和“reproduction process”中，證明BmPIWIs參與卵子形成（圖6.A、B、C）。</p>
<p>此外，通過構建smallRNA文庫對piRNA進行測序分析，與WT比較，突變個體中長度28nt,29nt and 30nt的piRNAs豐度均有所下降（圖6. D）。</p>
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<p style="text-align: center;">圖6. WT, Δsiwi and Δago3 卵巢RNA-seq結果</p>
<p>利用qRT-PCR檢測6種已知piRNA及7種TEs在Δsiwi和Δago突變個體卵巢組織中表達水平，piRNA表達水平下降（圖7.A），推測這些piRNA與BmSiwi結合。此外，在Δsiwi雌性個體中，TEs表達水平上調（圖7.B），可能由於其所受抑制減弱。</p>
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<p style="text-align: center;">圖7. 突變體中piRNAs和TEs qRT-PCR結果</p>
<p><strong>4、</strong><strong>HMT BmAsh2參與傢蠶性別決定</strong></p>
<p>結合RNA-seq及q RT-PCR結果發現，與WT相比，Δsiwi雌性突變個體中，三種組蛋白甲基轉移酶（HMT）BmAsh2, BmSETD2 和BmEggless表達水平有不同程度的下降（圖6. E）。利用CRISPR/Cas9 系統分別構建三種HMTs突變模型，結果發現Δash2和Δsetd2動物模型在翅膀形態異常，與Δsiwi和Δago3個體相似，雌性突變體表現出卵子形成異常（圖3），當中隻有Δash2與Δsiwi突變個體一樣，表現出部分性逆轉的特征（圖4），在Δash2突變體中檢測到Bmdsx發生可變剪切並且BmMasc的表達水平升高（圖5）。綜上證明，三種HMTs中，隻有BmAsh2參與傢蠶性別決定。</p>
<p><strong>5、</strong><strong>BmAsh2作為BmSiwi的協同因子起作用</strong></p>
<p>利用qRT-PCR檢測6種已知piRNA及7種TEs在Δash2 和Δsetd2動物模型卵巢組織中表達水平（圖7.C、D），推測BmAsh2與BmSETD2的調控都依賴piRNA。通過免疫染色可看到，BmAsh2分佈位置與BmSiwi相似（圖2.A）。通過免疫實驗檢測到Δash2突變體卵巢中組蛋白甲基化水平降低（圖8.A）。通過Western blotting檢測到Δsiwi 卵巢中BmAsh2蛋白水平降低，但在Δash2突變體卵巢中，BmSiwi轉錄水平及蛋白水平沒有明顯差異（圖8.C）。推測在性別決定通路中，BmAsh2並不作用於BmSiwi上遊。通過免疫沉淀實驗證明BmAsh2與BmSiwi直接互作（圖8.D）。由此證明在性別決定過程中，BmAsh2由BmSiwi及piRNA介導起功能，並預測出傢蠶性別決定分子機制（圖9）。</p>
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<p style="text-align: center;">圖8. 免疫染色及免疫沉淀實驗</p>
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<p style="text-align: center;">圖9. 傢蠶中BmAsh2參與性別決定機制模型</p>
<p>參考文獻：</p>
<p>Li Z, You L, Yan D, et al. Bombyx mori histone methyltransferase BmAsh2 is essential for silkworm piRNA-mediated sex determination[J]. PLoS genetics, 2018, 14(2):e1007245.</p>
<p>原文鏈接：</p>
<p>http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1007245</p>;
<p style="text-align: right;">劉拉拉<strong> 撰文</strong></p>
<p style="text-align: right;">TC 、一棵麥子 <strong>整理編輯</strong></p>
<p style="text-align: right;">本文系歐易生物原創</p>
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<p style="text-align: right;">轉載請註明本文轉自歐易生物</p> 此文章由<a href="http://www.adidas-lookbook.com.tw/gallery-696-grid.html">愛迪達拖鞋</a>推薦（<a href="http://www.adidas-lookbook.com.tw/gallery-696-grid.html">http://www.adidas-lookbook.com.tw/gallery-696-grid.html</a>;）


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